L'écozone des Prairies offre un habitat à de nombreuses espèces animales. Les mares et les étangs saisonniers des plaines constituent des aires d'accouplement, de repos et de nidification importantes pour la sauvagine qui emprunte la voie migratoire du centre de l'Amérique du Nord. Plus de la moitié de l'ensemble des oies et des canards de l'Amérique du Nord naissent dans les terres humides de l'écozone des Prairies. Les vallées fluviales offrent également des habitats importants où la faune peut s'abriter, notamment pendant les hivers rigoureux. Les Prairies offrent un habitat unique au chien de prairie, tandis que la région méridionale accueille l'iguane à petites cornes et le crotale de l'Ouest. L'ours noir, l'orignal, la gélinotte à queue fine, le castor et le renard roux se retrouvent au Manitoba. Diverses espèces de grenouilles et de crapauds y sont également présentes. Au nombre des espèces de poisson, mentionnons le doré jaune, le grand corégone et le grand brochet.

Compte tenu de la superficie et de la population de cette écozone, le nombre d'espèces sauvages menacées ou en danger de disparition est élevé. Au moins quatre espèces de vertébrés—le grizzli des plaines, le renard véloce, le putois d'Amérique et la grande poule-des-prairies— en sont disparus. Le faucon pèlerin, le pluvier montagnard, le courlis esquimau, le pluvier siffleur, la chouette des terriers et la grue blanche d'Amérique y sont menacés de disparition.

L'agriculture a probablement eu les incidences les plus importantes sur l'écozone. En remplaçant les espèces des prairies naturelles par des espèces cultivées, en drainant les terres humides et en rompant l'équilibre chimique naturel du sol par l'apport de pesticides, l'homme a profondément modifié le nombre et l'aire d'extension des espèces sauvages. De plus, des espèces concurrentes non indigènes ont été introduites.

Dans les écosystèmes aquatiques, des stocks de poisson de grande valeur, notamment le doré jaune et le doré noir, espèces très recherchées par les pêches commerciales et sportives, sont soumis à des pressions. La surpêche a fait diminuer les stocks qui sont sensibles à la qualité de l'eau des bassins où le drainage est contrôlé ainsi qu'aux fluctuations naturelles de niveau de l'eau. Ainsi, les contaminants provenant de l'utilisation à grande échelle de pesticides ont endommagé l'habitat du poisson.